空间转录组测序|着床前后小鼠胚胎的转录组时空图谱

哺乳动物早期胚胎发育期间发生的多个层次的细胞命运决定构建了整个发育蓝图，这是生命体最重要的分子事件之一【1】。

在早期胚胎着床后，伴随着从原始态多能性向始发态多能性的转变，囊胚中的内细胞团分化为胚区的上胚层和胚外区的脏内胚层(visceral endoderm)。而上胚层细胞通过原肠运动形成的外胚层、中胚层与内胚层是器官发生以及个体形成所需要的细胞基础【2】。

早期胚胎发育阶段的调控过程对整个胚胎发育产生了深远影响，因此有必要研究早期胚胎谱系的建立、不同胚层和组织前体的发生过程以及背后的分子调控机制【1】。

事实上，早在上世纪八九十年代，发育生物学家就已经初步建立了小鼠胚胎的细胞命运图谱。据此，科学家们发现在早期胚胎发育阶段，细胞的空间位置对于细胞命运具有重要影响。

近年来，单细胞测序技术使研究者们得以在单个细胞分辨度上构建胚胎细胞的发育轨迹【3-7】，进一步深入认识了胚胎发育过程。

但仅使用单细胞测序技术无法获得单个细胞真实的空间信息，导致研究者无法认识发育调控过程的时空变化。而空间位置信息，或者细胞在组织中天然的状态在发育生物学研究过程中具有十分重要的价值【8】。

为了探究小鼠早期胚胎发育阶段，特别是原肠运动时期胚层谱系的建立和细胞命运决定的分子机制，景乃禾研究组及其合作团队使用其开发的一种基于激光显微切割的低起始量空间转录组分析方法——Geo-seq，完成了着床前、后阶段胚胎的三维空间分子图谱。同时，还建立了目前国际上最全面、最完整的小鼠原肠运动时期转录组时空变化的交互性数据库【9】。

该研究成果2019年发表于Nature。

影响因子：43.070

第一作者：中科院广州生物医药与健康研究院/广州再生医学与健康广东省实验室彭广敦

通讯作者：中科院分子细胞科学卓越创新中心/生物化学与细胞生物学研究所景乃禾，中科院-马普学会计算生物学伙伴研究所韩敬东

通讯作者实验室：韩敬东研究员实验室

开放数据：RNA-seq数据存放于NCBI，编码GSE120963；RNA-seq数据还存放于NODE，编码OEP000320；开放的交互式数据库eGastrulation。

为了读取上胚层转录组的时空变化，研究者采用低通量RNA测序Geo-seq法分析原条中晚期胚胎上胚层细胞的转录组。

首先，研究者采用低温切片技术对包埋在OCT冰冻切片包埋剂中的E5.5(30um厚，S1-S3)、E6.0(15um厚，S1-S5/R1-R5)、E6.5(15um厚，S1-S8/R1-R8)、E7.0(15um厚，S1-S11/R1-R11)及E7.5(20um厚，S1-S10/R1-R10)时期小鼠胚胎进行连续切片，采用激光显微切割(LCM)技术从不同样本切片(S)中获取5-40个细胞，并进行RNA测序(图1a)。

除E5.5时期只有样本切片外，E6.0～E7.5的参考切片(R)用作模板构建胚胎3D结构(图1)。此外，不同时期、不同样本切片的位置划分也不同(图1a、b)；每个时期胚胎样本有额外的1-2个生物学重复(图1c)。

图1 用于Geo-seq分析的采样策略。a是不同胚胎时期样本的取样策略；b是数据结构介绍；c是用于Geo-seq的样本胚胎时期、生物学重复以及使用的胚层信息【10】。Epi，上胚层；En，内胚层；EA，内胚层前部；EP，内胚层后部；M，整个中胚层；MA，中胚层前部；MP，中胚层后部；A，前部；P，后部；AP，前部和后部混合；L，左侧(1，左前；2，左后)；R，右侧(1，右前；2，右后)；A↔P，前-后；P↔D，近端-远端；L↔R，左-右。

采用上述采样策略，研究者获得了胚胎早期发育阶段，胚层特定位置上丰富的编码和非编码RNA动态变化数据。据此构建的数字可视化2D、3D玉米图为进一步分析提供了分子切入点。

为了认识小鼠胚胎着床前、后的转录组变化，研究者将Geo-seq数据与前人研究中E2.5桑椹胚、E3.5囊胚内细胞团以及E4.5上胚层和原始内胚层RNA数据【11】相结合，进行分析。

根据调节子(regulon)序列构建的系统发育树显示(图2)：

❄ 存在6个谱系聚群，每个代表着早期胚胎的主要组织类型：着床前和围着床期、上胚层(Epi)、原条(PS)、外胚层(Ect)、中胚层(M)及内胚层(En)；

❄ E6.5-E7.0阶段的原条细胞与E7.5阶段原条细胞分离，表明不同发育时期的原条存在异质性(原肠胚形成早期和晚期)；

❄ E5.5-E7.5内胚层样本组成了一个聚群，与上胚层、外胚层及中胚层组织分离；

❄ 内胚层聚群与着床前和围着床期胚胎关系更近，而不是原肠胚形成阶段胚胎；

❄ 中胚层与包含原条的上胚层后部，及E7.5时期、来源于上胚层前部的外胚层细胞有联系。

这些结果表明，调节子的时空转录特性可以用于注释早期胚胎细胞群的可能发育联系。

图2 系统发育树展示了着床前到原肠胚形成期间胚胎组织的分类【10】。

为了认识早期胚胎着床前后不同细胞谱系的发育轨迹，研究者对E2.5-E7.5组织样本的调节子转录活性进行分析，结果显示：

❄ 存在9个(G1-G9)转录因子驱动的调节子聚群，与6个主要谱系聚群相关(图3a)；

❄ 内胚层组织与原始内胚层存在联系，与上胚层及其衍生组织相分离(图3b)；

❄ 中胚层和外胚层联系密切，且都位于E4.5时期上胚层分支的发育轨迹中(图3b)；

❄ 比较流行的观点认为定型内胚层(definitive endoderm)主要来源于原条，但分析结果显示原肠胚形成阶段胚胎的内胚层在转录上与原始内胚层或脏内胚层更相似(图3b)；

❄ E7.0和E7.5阶段胚胎远端位置处的中胚层组织与邻近内胚层存在联系，指出了上胚层来源内胚层的可能位置(图3c)；

❄ 只对中胚层和外胚层组织进行聚类分析，结果显示E7.5时期中胚层和外胚层存在明显分离(图3d)。

图3 a是调节子活性分值热图及GO富集分析结果，右侧PC1-4是每个调节子的主成分贡献率，下方PC1-4是每个样本的映射分数；b是组织样本调节子活性矩阵的主成分分析(PCA)结果，其中箭头表示发育轨迹；c是E5.5-E7.5时期胚胎的原条、中胚层及内胚层PCA及t-SNE降维聚类结果；d是E5.5-E7.5时期胚胎的原条、中胚层及内胚层调节子活性热图(左)，及其相应调节子聚群的平均活性玉米图(右)【10】。PI，着床前；END，内胚层；PS，原条；EPI，上胚层；ECT，外胚层；MES，中胚层。

此外，G1-G9聚群的平均活性分布PCA(主成分分析)图和玉米图揭示了与聚群相关的和胚层相关的决定因素(图4)：

❄ G1调节子在E7.5阶段中胚层和上胚层后部-原条样本中富集，G9特异性的富集于着床前的胚胎细胞；

❄ G6包含与Sall2、Sox2和Otx2相关的转录因子网络，在围着床期样本中富集；

❄ 富集了细胞周期相关的G4调节子聚群与内胚层及多数着床后胚胎的上胚层组织有联系，表明分化活性可能具有胚层倾向性；

❄ G3聚群与内胚层早期的分离有关，G5聚群与内胚层晚期的分离有关。

图4 胚胎组织中，聚群G1和G5的平均调节子活性PCA图(上)及玉米图(下)【10】。

为了进一步分析调节子间的相互作用，研究者使用web工具GAIN确定了主要调节子【12】，发现这些调节子多是已知的谱系特异性基因，其中一些与胚层相关突变体表型有关，表明原肠胚形成时期这些调节子促进了胚胎形式(embryonic patterning)的发生(图5)。

图5 共表达网路分析结果。其中棕色线表示正相互作用，绿色线表示负相互作用，三角节点表示MGI数据库中收录有敲除该转录因子后，原肠胚形成期间的表型信息。

为了确定预测的转录因子(调节子的)对特定组织谱系发育而言是必须的，研究者在胚胎干细胞中分别敲除了G7聚群的Sp1基因，G8聚群的Hmga2基因以及G1聚群的Hmgb3基因，发现配胚胎干细胞多能性降低。因而，转录组的时空变化可以指示着床后发育期间，调控谱系分离并驱动胚层分化的遗传活动(图6)。

图6 基因敲除后引起的其他基因表达水平变化。其中，a是敲除Sp1后引起初始标记基因(Rex1、Esrrb及Nanog)表达下调，构成标记基因(formative markergenes)表达上调(Sall2、Fgf5和Pou3f1)；b是敲除Hmgb3后引起与躯干中胚层(trunk mesoderm)祖细胞有关的基因表达上调（Cdx2、Cdx4、Hoxa1和Tbx6），而中内胚层祖细胞的标记基因表达水平没有发生变化；c是敲除Hmga2后，在胚胎干细胞分化第6天，发现心脏祖细胞标记基因表达下调；d是敲除Hmga2后，在胚胎干细胞分化第12天，发现心肌细胞标记基因表达下调【10】。

躯体模式(body plan)指的是在一个门分类阶元下，许多动物都具有的一组形态特征【13】。研究者构建的着床后胚胎转录组时空图谱使其可以深入研究躯体模式的结构及其分子属性。

为此，研究者对不同发育阶段胚胎的差异表达基因(DEGs)分别进行聚类分析，发现：

❄ E5.5和E6.5时期胚胎上胚层整体同质性较高(图7a)；

❄ E6.5时期胚胎上胚层被分成A和P两个域(表达不同的基因)，P以表达原条相关基因为特征，如T、Mixl1和Mesp1(图7b)；

❄ 原肠胚形成期间，上胚层进一步分成前部、后部及侧面3个域(图7c、d)；

❄ E7.5时期，中胚层分成前部和后部两个域(图7d)；

❄ 存在独特的胚胎结构，如E7.5时期原条前部及邻近内胚层组织中G5聚群DEGs的特异性表达揭示了节点的存在(图7e)；

❄ 在E5.5-E6.5阶段，内胚层特异性地表达脏内胚层D和A的标记基因，但不存在区域化差异(图7a-c)。

图7 不同发育时期胚胎DEGs降维聚类分析结果【10】。a是E5.5和E6.0时期胚胎DEGs聚群的热图和玉米图；b-d是E6.5、E7.0和E7.5时期胚胎DEGs聚群的热图和玉米图；e是原肠胚形成期间，E7.5时期3个基因(G5基因聚群)的动态表达玉米图及其整体原位杂交结果。Epi，上胚层；E，内胚层；M，整个中胚层；MA，中胚层前部；MP，中胚层后部；PS，原条；A，前部；P，后部；AP，前部和后部混合；L，左侧(1，左前；2，左后)；R，右侧(1，右前；2，右后)。

内胚层远端-近端分离的早期信号在E6.0时期开始明显(图8a)。为了揭示远端-近端域上内胚层聚群的异质性，研究者对额外的E7.0时期内胚层样本中的384个细胞的单细胞RNA数据进行分析，发现：

❄ 存在两个紧密联系的单细胞(SC)聚群，具有脏内胚层特征但表达不同水平的Sox17和Sox7，移除一个较小聚群后发现这两个紧密联系的SC聚群表达原条标记基因(图8b-d)；

❄ 将单细胞数据与内胚层Geo-seq数据进行反卷积比较，发现SC-En1和SC-En2聚群被划分成内胚层(E1和E2)(图8e)；

❄ 反卷积结果显示，SC-En1聚群被划分到E7.0时期胚胎内胚层D域，而SC-En2聚群被划分到E7.0时期胚胎内胚层P域(图8e)；

图8 胚层组织的分子结构及其空间关联【10】。a是E5.5-E7.5胚胎的组织和胚层DEGs表达谱定义的细胞群空间域；b是E7.0内胚层单细胞数据的降维聚类结果及去除较小聚群后的重聚类结果；c是SC-En1和SC-En2聚群中Sox17和Sox7的表达水平；d是SC-En1和SC-En2聚群中的谱系特异性标记基因表达水平；e是SC-En1和SC-En2聚群与Geo-seq法获得的内胚层样本数据的反卷积分析结果，并展示了不同细胞类型的比例。

为了确认胚胎间异质性的影响，研究者计算了每个发育时期生物学重复样本间的Spearman相关系数，结果显示生物学重复样本间，空间域的总体分布表现出高度一致性，表明原肠胚形成阶段胚层上细胞群的胚胎模式高度同步(图9)。

图9 部分展示了E5.5-E6.5阶段生物学重复样本间，空间域的相关性【10】。

根据不同发育时期调节子平均活性分值(E2.5-E7.5，不包含单细胞RNA数据)的相关性分析结果，发现显示沿着发育轨迹存在一种分子结构及相应调控网络(图9a、10a)：

❄ E7.5时期外胚层P和中胚层P与E7.0时期原条存在联系(图10a)；

❄ E7.0时期原条A-D区域的T和Sox2活性高，表明可能存在神经-中胚层祖细胞【14】(图3)；

❄ E7.5前，内胚层的主要组成细胞与初始内胚层和脏内胚层存在联系(图10a)；

❄ 由于E7.0时期内胚层的3个SC聚群间存在原条样细胞，且E7.5时期内胚层远端(E1)与中胚层存在联系，因而E1细胞聚群可能起源于原条，且在原肠胚形成晚期穿过中胚层【7、15-16】(图8bd、图10a)；

前人谱系追踪研究报道了胚胎外的细胞状态向内胚层靠拢【17】，以上发现验证了这一研究结果。

总之，发育轨迹分支节点处调节子的转换模式及其连续过渡显示出胚层发育期间，调控组织命运特化的分子复杂的动态变化(图10b)。

图10 a是根据E2.5-E7.5阶段胚胎组织调节子平均活性构建的空间域关系；b是根据E2.5-E7.5阶段胚胎组织间调节子聚群的联系，构建的组织间关系【10】。其中，MOR，桑椹胚；ICM，内细胞团；PrE，初始内胚层；TE，滋养外胚层。空间域：上胚层(Epi)，Epi1–3；内胚层(En)，E1–3；外胚层，Ect1–3；中胚层，M、MA和MP。

为了确定调控组织模式(tissue patterning)的关键信号活性，研究者对G1-G9调节子聚群进行富集分析，结果显示：

❄ 6个信号通路在胚层不同位置上的活性不同(激活或抑制活性)(图11a)；

❄ 仅中胚层和内胚层相关调节子聚群G1、G3、G5和G8显著富集了激活的信号(图11b)；

❄ Hippo-Yap信号通路在营养外胚层分离中起到了重要作用【18】，但这并不是原肠胚形成阶段胚胎的典型特征，然而研究者发现该通路在内胚层中显著富集(图11c)；

❄ 使用YAP抑制剂维替泊芬阻断内胚层外植体的Hippo-Yap信号活性，引起了脏内胚层标记基因和早期内胚层相关G3聚群表达下调，但晚期内胚层的标记基因表达水平没有变化(图11d-f)。

这些发现意味着Hippo信号可能参与调控早期内胚层的发育。

图11 着床后胚胎的区域化信号活性【10】。a是E5.5-E7.5阶段，Hippo-Yap信号通路激活态(A)和抑制态(I)相关的靶基因活性玉米图(上)以及不同信号通路在3个胚层中的活性分布；b是G1-G9调控子基因聚群中富集的激活态(A)和抑制态(I)信号通路；c是qPCR分析结果，显示的是E7.5时期胚胎中4个Hippo-Yap信号通路组分的表达水平玉米图(上)，以及E7.0胚胎的原位杂交结果(下)；d是YAP抑制剂处理的E7.0时期内胚层外植体的实验策略；e是Hippo-Yap通路因子(上)和脏内胚层标记基因(下)的表达水平；f是YAP抑制剂处理后，内胚层外植体中G3调节子聚群活性分值变化。

以上分析揭示了已知的胚层标记基因平均表达水平和活性分值的空间模式，研究者据此构建了上胚层的连续分子命运图谱。根据图谱，研究者发现：

❄ E7.0和E7.5时期，上胚层前部获得了外胚层多能性(图12a)；

❄ E7.0时期，上胚层后部远端获得了中胚层-内胚层多能性，随后在E7.5时期获得了中胚层多能性(图12a)；

❄ E7.0时期，外胚层表面的祖细胞聚集到上胚层前部近端，随后在E7.5时期聚集到上胚层近端-侧面(图12a)；

❄ 该分子命运图谱大致总结了前人建立的细胞命运图谱【19】(图12 b)。

图12 上胚层的分子命运图谱。a是在E6.5-E7.5阶段的上胚层-外胚层内，不同细胞聚群中胚层相关基因的相对表达水平玉米图(左)和根据组织标记基因表达模式构建的主要胚层分析命运图谱；b是前人构建的胚胎细胞命运图谱。

围着床期间的胚胎细胞展现出连续的多能性变化【20】。为了探究这一变化，研究者构建了与不同多能状态相关的调节子【11】的表达谱，发现：

❄ 原始态多能态相关的调节子网络在着床后消失(图13a)；

❄ 在E5.5时期上胚层中检测到构成多能态(formative pluripotency states)相关的基因转录，这些相关基因在E6.5时期上胚层前部首次出现区域化，并在E7.0-E7.5阶段上胚层-外胚层前部中仍保持着区域化(图13a)；

❄ 初始多能态的获得在E6.5上胚层后部较为明显，相一致的是，上胚层后部富集了上皮-间充质转变(EMT)相关基因(图13b)；

❄ 向初始多能态的转化持续到E7.0时期，在E7.5时期降低(图13a)。

这些结果显示，上胚层细胞群多能态的区域性变化(排除谱系分化)不是同时发生的(图13c)。

图13 围着床期间胚胎细胞发生的多能性变化【10】。a是E2.5-E7.5阶段胚胎中，原始、构成及初始多能态相关的基因表达域的活性分析结果；b是EMT相关基因的平均表达水平玉米图；c是E5.5-E7.5胚胎，上胚层-外胚层多能态的转变。

该研究构建了胚胎早期发育阶段转录组时空图谱，这一图谱为研究谱系分化和组织模式过程中分子活性的时空变化提供了基础，揭示了驱动谱系发育的主要调节子机制，细致展示了上胚层起源胚层的分子结构和发育轨迹。

“在此之前，科学家们通过原位杂交或者原位荧光染色对一些基因表达的空间分布进行了研究，但这是这些研究方案的通量较低，也较难掌握。”彭广敦研究员说到。“我们的方法则是通过激光显微切割在组织上直接捕获细胞，保留了每个样本的位置信息。”【21】

凭此方法，景乃禾研究员及其合作者成功绘制了一张同时包含时间、空间信息的高精度细胞“成长轨迹”三维立体图。通过这张百科全书式全基因组的发育轨迹图谱，研究者可以追溯不同胚层细胞起源【21】。

此外，他们还使用这一图谱，找到了许多在胚层谱系发生过程中的关键转录因子，首次发现Hippo-Yap信号通路在内胚层谱系发生过程中具有重要作用。

以往研究结果显示，内胚层全部由上胚层发育而来。而根据这一图谱，研究者发现有一部分内胚层极有可能直接来自于原始内胚层【9, 21】。

这项工作为理解胚层谱系建立及多能干细胞的命运调控机制提供了详实数据和崭新思路，是对经典发育生物学层级谱系理论的重要修正和补充，将推动早期胚胎发育和干细胞再生医学相关领域的发展【9】。

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参考文献

1.叶瑞优(责编).(2019).“小鼠早期胚胎全胚层谱系发生的时空转录组图谱问世”. 中国科学院. http://www.cas.cn/syky/201908/t20190808_4709237.shtml

2. (2019)."生命学院颉伟组报道哺乳动物早期胚胎多能性谱系独特的染色质状态及其分子机制与功能". 清华大学实验动物中心. http://www.larc.tsinghua.edu.cn/post/1020

3. Grifths, J. A., et al. (2018). "Using single-cell genomics to understand developmental processes and cell fate decisions." Mol. Syst. Biol., 14: e8046.

4. Kumar, P., Tan, Y. & Cahan, P. (2017). "Understanding development and stem cells

using single cell-based analyses of gene expression." Development, 144: 17-32.

5. Pijuan-Sala, B. et al. (2019). "A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis." Nature, 56: 490-495.

6. Cao, J. et al. (2019). "The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis." Nature, 566: 496-502.

7. Nowotschin, S. et al. (2019). "The emergent landscape of the mouse gut endoderm at single-cell resolution." Nature, 569: 361-367.

8.彭广敦. (2017). "景乃禾组建立空间转录组测序新方法丨BioArt推荐"Bioart.

9. 周帆和汤富酬. (2019). "专家点评Nature | 景乃禾/韩敬东/彭广敦合作绘制小鼠早期胚胎发育全胚层谱系发生时空转录组图谱"https://zhuanlan.zhihu.com/p/77182486

10. Peng, Guangdun, et al. (2019). "Molecular architecture of lineage allocation and tissue organization in early mouse embryo." Nature, 572(7770): 528-532.

11. Boroviak, T. et al. (2015). "Lineage-specifc profling delineates the emergence and progression of naive pluripotency in mammalian embryogenesis." Dev. Cell, 35:366-382.

12. Fuxman Bass, J. I. et al. (2013). "Using networks to measure similarity between genes: association index selection." Nat. Methods, 10: 1169-1176.

13. (2019). "Body plan" Wikipedia.https://en.wikipedia.org/wiki/Body_plan

14. Henrique, D., et al. (2015). "Neuromesodermal progenitors and the making of the spinal cord." Development, 142: 2864-2875.

15. Viotti, M., et al. (2014). "SOX17 links gut endoderm morphogenesis and germ layer segregation." Nat. Cell Biol., 1: 1146-1156.

16. Kwon, G. S., et al. (2008). "The endoderm of the mouse embryo arises by dynamic widespread intercalation of embryonic and extraembryonic lineages." Dev. Cell, 15: 509-520.

17. Chan, M. M. et al. (2019). "Molecular recording of mammalian embryogenesis." Nature, 570: 77-82.

18. Nishioka, N. et al. (2009). "The Hippo signaling pathway components Lats and Yap pattern Tead4 activity to distinguish mouse trophectoderm from inner cell mass." Dev. Cell, 16: 398-410.

19. Wilson, V. & Beddington, R. S. (1996). "Cell fate and morphogenetic movement in the late mouse primitive streak." Mech. Dev., 55: 79-89.

20. Smith, A. (2017). "Formative pluripotency: the executive phase in a developmental continuum." Development, 144: 365-373.

21. 郜阳. (2019). "我是谁？我从哪里来？上海科学家为早期胚胎细胞给出答案" 新名晚报. https://wap.xinmin.cn/content/31568171.html

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